超分辨率三種顯微技術(shù)的研究

熒光顯微鏡和熒光顯微技術(shù)：熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。熒光顯微技術(shù)是應(yīng)用短波光照射被測物質(zhì)以激發(fā)其發(fā)射熒光從而在熒光顯微鏡下觀察。
2、單分子熒光成像

當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源的時候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來進(jìn)行精確定位。而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個熒光分子的時候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級。在同樣的信噪比圖像上，用高斯函數(shù)擬合單分子熒光的點擴散函數(shù)可以達(dá)到最佳的定位精度．Thompson 等科學(xué)家結(jié)合了理論推導(dǎo)和計算機模擬，綜合考慮了各種因素的影響，如離散時間段檢測到的發(fā)出光子數(shù)的泊松噪聲、CCD 相機的背景讀出噪聲以及CCD 像素點的大小等，得到了單分子在二維定位精度上的近似公式： 其中x 為定位的誤差，s 為點擴散函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方差，a為CCD 像素的大小，N 為收集到的光子數(shù)，b 為背景噪聲。

PALM和STORM：盡管單分子的定位精度可以達(dá)到納米級，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個或者多個點光源時的分辨率。2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz 等在Science 上提出了光激活定位顯微技術(shù)：是用PA-GFP 來標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)405 nm 激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用488 nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子．在確定這些分子的位置后，再長時間使用488 nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來．之后，分別用405 nm 和488 nm激光來激活和漂白其他的熒光分子，進(jìn)入下一次循環(huán)．這個循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位．將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10 倍以上分辨率的顯微技術(shù)，如圖所示，PALM 顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達(dá)到1 nm 的數(shù)量級。 PALM 的成像方法只能用來觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力．2006 年底，美國霍華德- 休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇實驗組開發(fā)出來一種類似于PALM的方法，可以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位：隨機光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)：將Cy3和Cy5分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白．應(yīng)用特定波長的激光來激活探針，然后應(yīng)用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環(huán)上百次后就可以得到最后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像。
3、STED（受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)）

用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)(既可以是化學(xué)合成的染料也可以是熒光蛋白)發(fā)光的同時，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、環(huán)型的、波長較長的激光將第一束光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程猝滅，從而減少熒光光點的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率． STED成像技術(shù)的最大優(yōu)點是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實時變化的過程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛。

將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。

掃描隧道顯微鏡弱點

(1).對觀察樣品限制較多，例如樣品必須是導(dǎo)體，不能是非導(dǎo)體和溶液等。

(2).對樣品環(huán)境有嚴(yán)格要求，如要求高真空等。 

(3).對觀察的對象都過多過少造成損害，而光學(xué)顯微鏡對樣品的限制極少，可以是非導(dǎo)體或液體，可以是有生命的也可以實物生命的，可以是透明的也可以是不透明甚至發(fā)光的，不僅可以觀察處于靜態(tài)的樣品還可以觀察動態(tài)情況下的樣品。至于樣品環(huán)境更無特殊要求，可以使常溫大氣壓，也可以是非常溫和非常壓的環(huán)境，觀察對物體不造成損傷則更是光學(xué)顯微鏡的一大優(yōu)點。
5、掃描隧道顯微鏡的工作原理

掃描隧道顯微鏡就是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)與原理，通過探測固體表面原子中的電子的隧道電流來分辨表面形貌的顯微裝置。根據(jù)量子理論，由于電子的隧道效應(yīng)，金屬中的電子并不完全局限于金屬表面之內(nèi)，電子云密度并不是在表面邊界處突變?yōu)榱?。在金屬表面以外，電子云密度呈指?shù)衰減，衰減長度約為1nm。用一個極細(xì)的、只有原子線度的金屬針尖作為探針，將它與被研究物質(zhì)（樣品）的表面作為兩個電極，當(dāng)樣品表面與針尖非?？拷ň嚯x（1nm）時，兩者的電子云略有重疊，若在兩極間加上電壓Vb，在電場作用下電子就會穿過兩個電極之間的勢壘，通過電子云的狹窄通道流動，從一極流向另一極，形成隧道電流I。隧道電流I的大小與針尖和樣品間的距離S以及樣品表面平均勢壘的高度有關(guān)。關(guān)系式為：

 I∝Vbexp(-Aφ^(1/2) S)

類似于隱失波在界面上的衰減，高分辨率正是因為這種指數(shù)衰減對距離的敏感性。由此可見，隧道電流I對針尖與樣品表面之間的距離S極為敏感，如果S減小0.1nm，隧道電流就會增加一個數(shù)量級，當(dāng)針尖在樣品表面上方掃描時，即使其表面只有原子尺度的起伏，也將通過其隧道電流顯示出來。借助于電子儀器和計算機，在頻幕上即顯示出樣品的表面形貌。