顯微鏡組織與結構

 

　　簡史  

 

　　早在公元前 1世紀，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認識。1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國的J.開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結構，當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。17世紀中葉，英國的R.胡克和荷蘭的 A.van列文胡克都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻。1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明系統(tǒng)和承載標本片的工作臺。這些部件經(jīng)過不斷改進，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡,其中9臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡在動、植物機體微觀結構的研究方面取得了杰出的成就。19世紀，高質量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)使顯微鏡觀察微細結構的能力大為提高。1827 年G.B.阿米奇第一個采用浸液物鏡。19世紀70年代，德國人E.阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。這些都促進了顯微鏡制造和顯微觀察技術的迅速發(fā)展，并為19世紀后半葉包括R.科赫、L.巴斯德等在內的生物學家和醫(yī)學家發(fā)現(xiàn)細菌和微生物提供了有力的工具。  

 

　　在顯微鏡本身結構發(fā)展的同時，顯微觀察技術也在不斷創(chuàng)新：1850年出現(xiàn)了偏光顯微術，1893年出現(xiàn)了干涉顯微術，1935年荷蘭物理學家F.澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術，他為此在1953年被授予諾貝爾物理學獎金。 

 

　　古典的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器?，F(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝象管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計算機后構成完整的圖象信息采集和處理系統(tǒng)。 

 

　　工作原理表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡可以使物體放大成像。光學顯微鏡就是利用這一原理把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。近代的光學顯微鏡通常采用兩級放大，分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體AB位于物鏡的前方,被物鏡作第一級放大后成一倒立的實象A1B1。然后此實像再被目鏡作第二級放大，成一虛象A2B2,人眼看到的就是虛像，顯微鏡的總放大倍率為：顯微鏡總放大倍率＝物鏡放大倍率×目鏡放大倍率  

 

　　放大倍率是指直線尺寸的放大比而不是面積比。在用人眼直接觀察的顯微鏡中,可以在實像面A1B1處放置一塊薄型平板玻璃片，其上刻有某種圖案的線條，例如十字線。當實像A1B1和這些刻線疊合在一起時,利用這些刻線就能對物體進行瞄準定位或尺寸測量。這種放置在實像面處的薄型平板玻璃片通稱分劃板。在新型的以光電元件作為接收器的光學顯微鏡中，電視攝象管的靶面或其他光電元件的接收面就設置在實像面上。  

 

　　組成  

 

　　光學顯微鏡由載物臺、聚光照明系統(tǒng)、物鏡、目鏡和調焦機構組成。 載物臺 用于承放被觀察的物體。利用調焦旋鈕可以驅動調焦機構使載物臺作粗調和微調的升降運動，使被觀察物體調焦清晰成象。它的上層可以在水平面內沿、方向作精密移動和在水平面內轉動，把被觀察的部位調放到視場中心。 

 

　　聚光照明系統(tǒng) 由燈源和聚光鏡構成。當被觀察物體本身不發(fā)光時，由外界光源給以照明。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應。聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。 

 

　　物鏡位于被觀察物體附近實現(xiàn)第一級放大的鏡頭。在物鏡轉換器上同時裝著幾個不同放大倍率的物鏡。轉動轉換器可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。物鏡放大倍率通常為5～100倍。物方視場直徑（即通過顯微鏡能看到的圖像范圍）約為 11-20毫米。物鏡放大倍率越高則視場越小。物鏡是顯微鏡中對成象質量優(yōu)劣起決定性作用的光學元件。常用的有：①能對兩種顏色的光線校正色差的消色差物鏡；②質量更高的能對三種色光校正色差的復消色差物鏡；③能保證物鏡的整個像面為平面以提高視場邊緣成像質量的平像場物鏡。為了提高顯微觀察的分辨率，在高倍物鏡中采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體。  

 

　　目鏡位于人眼附近實現(xiàn)第二級放大的鏡頭。目鏡放大倍率通常為5～20倍，按能否放置分劃板,可分成兩類：①不宜放置分劃板的，如惠更斯型目鏡。這是現(xiàn)代顯微鏡中常用的型式，優(yōu)點是結構簡單、價格低廉；缺點是由于成像質量的原因，不宜放置供瞄準定位或尺寸測量用的分劃板。②能放置分劃板的，如凱爾納型和對稱型目鏡，它們能克服上述目鏡的缺點。按照能看到的視場大小，目鏡又分為視場較小的普通目鏡和視場較大的大視場目鏡（或稱廣角目鏡）兩類。  

 

　　調焦機構  

 

　　載物臺和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對運動以實現(xiàn)調焦，獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時，容許的調焦范圍往往小于微米，所以顯微鏡必須具備極為精密的微動調焦機構。  

 

　　顯微鏡放大倍率的極限 顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。儀器的分辨率是指儀器提供被測對像微細結構信息的能力。分辨率越高則提供的信息越細致。顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距。根據(jù)衍射理論，顯微物鏡的分辨率為 sigma=0.61lamda/N.式中l(wèi)amda為所用光波的波長；N 為物體所在空間的折射率，物體在空氣中時N=1；U為孔徑角，即從物點發(fā)出能進入物鏡成像的光線錐的錐頂角的半角;NsinU 稱為數(shù)值孔徑。當波長λ一定時，分辨率取決于數(shù)值孔徑的大小。數(shù)值孔徑越大則能分辨的結構越細，即分辨率越高。數(shù)值孔徑是顯微物鏡的一個重要性能指標，通常與放大倍率一起標注在物鏡鏡筒外殼上，例如40×0.65表示物鏡的放大倍率為40倍，數(shù)值孔徑為0.65。   

 

　　分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像。這種過度的放大倍率稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的潛在能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配，以滿足下列條件： 500NsinU＜顯微鏡總放大倍率＜1000NsinU ~2  

 

　　在此范圍內的放大倍率稱為有效放大倍率。由于sinU永遠小于1，物方空間折射率N最高約為1.5，NsinU不可能大于1.5，故光學顯微鏡的分辨率受 (1)式限制，具有一定的極限。有效放大倍率受上式限制,一般不超過1500倍。顯微鏡使用者應由所需分辨的最小尺寸按(1)式確定所需的數(shù)值孔徑，選定物鏡,然后按(2)式選定總放大倍率和目鏡放大倍率。提高分辨率的途徑是：采用較短波長的光波或增大孔徑角U值，或是提高物體所在空間的折射率N，例如在物體所在空間填充折射率為 1.5的液體。以這種方式工作的物鏡稱為浸液物鏡。而電子顯微鏡正是利用波長極短的特性，在提高分辨率方面取得重大突破的。 聚光照明系統(tǒng)對顯微觀察的影響聚光照明系統(tǒng)是對顯微鏡成像性能有較大影響但又易于被使用者忽視的環(huán)節(jié)。它的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發(fā)來的光束應能保證充滿物鏡孔徑角，否則就不能充分利用物鏡所能達到的最高分辨率。為此目的，在聚光鏡中設有類似照相物鏡中的可以調節(jié)開孔大小的可變孔徑光闌，用來調節(jié)照明光束孔徑，以與物鏡孔徑角匹配。觀察高反差物體時，宜使照明光束充滿物鏡的全孔徑；對于低反差物體,宜使照明光束充滿物鏡的2/3孔徑。在較完善的柯勒照明系統(tǒng)中，除可變孔徑光闌外，還裝有控制被照明視場大小的可變視場光闌，以保證被照明的物面范圍與物鏡所需的視場匹配。物面被照明的范圍太小固然不行，過大則不僅多余，甚至有害，因為有效視場以外的多余的光線會在光學零件表面和鏡筒內壁多次反射，最后作為雜散光到達像面，使圖像的反差下降。  

 

　　改變照明方式，可以獲得亮背景上的暗物點（稱亮視場照明）和暗背景上的亮物點（稱暗視場照明）等不同的觀察方式，以便在不同情況下更好地發(fā)現(xiàn)和觀察微細結構。  

 

　　分類光學顯微鏡有多種分類方法：①按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；②按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；③按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；④按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；⑤按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和激光顯微鏡等；⑥按接收器類型可分為目視、攝影和電視顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外熒光顯微鏡等。 雙目體視顯微鏡利用雙通道光路為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。雙目體視顯微鏡在生物、醫(yī)學領域廣泛用于切片操作和顯微外科手術；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。  

 

　　全相顯微鏡專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體的金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。 偏光顯微鏡用偏振光對物體進行觀測的顯微鏡。它的工作原理是在普通顯微鏡的照明光路中加入起偏器，使照到物面上的照明光束變成具有單一偏振方向的偏振光。在物鏡和目鏡之間的成像光路中加入檢偏器，它的偏振方向與起偏器的偏振方向互成90°。如果被觀物體不改變入射照明光束的偏振狀態(tài)，則出射光便被檢偏器完全阻擋，不能形成圖像；如果被觀物體改變入射光的偏振狀態(tài),則有一部分光通過檢偏器,提供某些原來在非偏振光中發(fā)現(xiàn)不了的圖像信息。偏光顯微鏡在地質、生物、材料工程等領域中用于觀測晶體雙折射、晶軸方向和偏振面旋轉。 紫外熒光顯微鏡 用紫外光激發(fā)熒光來進行觀察的顯微鏡。某些標本在可見光中覺察不到結構細節(jié)，但經(jīng)過染色處理，以紫外光照射時可因熒光作用而發(fā)射可見光，形成可見的圖像。這類顯微鏡常用于生物學和醫(yī)學中。  

 

　　相襯顯微鏡和微差干涉對比顯微鏡利用相位差和干涉原理來提高觀察效果的顯微鏡。在普通顯微鏡中，圖像的對比度是由于物體各部位對光的吸收率不等而造成的。但在某些細胞組織和金屬結構中，各部位的吸收率差別太小，以致不能形成可覺察的對比度。對于這類物體往往需要進行染色處理（對細胞組織）或酸腐蝕處理(對金屬)以造成可見的對比差別。而這些處理過程可能引入人為的假像，從而歪曲原有特征的真實性。相襯法和微差干涉對比法就是為了避免這些缺點而發(fā)展起來的。當光波通過吸收率相等或相近的各個部位時，吸收率可能沒有差別，但通過各部位的光程差可能不等。相襯法和微差干涉對比法利用干涉效應把通常情況下人眼不可見的光程差轉換成可見的亮暗差，形成可見的結構對比圖像。這類顯微鏡廣泛用于金屬學、醫(yī)學和集成電路制備工藝中。   

 

　　紅外顯微鏡 用紅外光源照明和成像的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入紅外變像管，把不可見的紅外圖像轉換成可見圖像。利用某些物體對紅外光的透射或反射特性來觀察在可見光中覺察不到的結構。這類顯微鏡用于贗品鑒別、硅晶片表面缺陷檢測等。電視顯微鏡和電荷耦合器顯微鏡以電視攝像靶或電荷耦合器作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入電視攝像靶或電荷耦合器取代人眼作為接收器，通過這些光電器件把光學圖像轉換成電信號的圖像，然后對之進行尺寸檢測、顆粒計數(shù)等工作。這類顯微鏡的主要優(yōu)點是與計算機聯(lián)用后便于實現(xiàn)檢測和信息處理的自動化，應用于需要進行大量繁瑣的檢測工作的場合。 掃描顯微鏡成像光束能相對于物面作掃描運動的顯微鏡顯微鏡使用者所關心的主要性能指標有兩個:一是標志著提供信息的細致程度的分辨率高低；二是標志著一次獲取信息數(shù)量的被觀視場大小。這兩個指標一般是互相矛盾和制約的。在掃描顯微鏡中依靠縮小視場來保證物鏡達到最高的分辨率，同時用光學或機械掃描的方法使成像光束相對于物面在較大視場范圍內進行掃描，并用信息處理技術來獲得合成的大面積圖像信息。